Το μοναστήρι του Τιμίου Σταυρού ιδρύθηκε το 1592 από τον μοναχό Νείλο, ένας από τους ιδρυτές Μονής Μεγάλης Παναγιάς.
Ο μοναχός Νείλος, μετά από έξι χρόνια διαμονής του στο Μοναστήρι της Μεγάλης Παναγιάς, το 1592 ήρθε στην περιοχή αυτή και έχτισε ένα νέο εκκλησάκι προς τιμή του Τιμίου Σταυρού, στο ίδιο σημείο όπου είχαν βρει ομώνυμη εικόνα.
Το1604 έγινε επέκταση του μοναστηριού, ενώ στις 7 Μάη του 1838 μπήκε ο θεμέλιος λίθος της μεγάλης βασιλικής εκκλησία με τους τρεις θόλους, η οποία αντικατέστησε το εκκλησάκι του μοναχού Νείλου, που είχε αρχίσει να καταρρέει. Για την κατασκευή του ναού, ο ηγούμενος της Μονής Γρηγόριος, ζήτησε την οικονομική στήριξη των κατοίκων της περιοχής, η οποία ήταν άμεση και με μεγάλη ανταπόκριση, όπως βλέπουμε και από το αποτέλεσμα, μέσα και έξω από την εκκλησία.
Αξιοσημείωτο είναι το επιχρυσωμένο ξυλόγλυπτο του Ιερού Άμβωνας του 1843, ο δεσποτικός θρόνος του 1844, και η εκπληκτικής τεχνικής, ξυλόγλυπτο τέμπλο του 1854, που απεικονίζει σκηνές από την Παλαιά και την Καινή Διαθήκη. Η μεγάλη τοιχογραφία των Αγίων Κωνσταντίνου και Ελένης που βρίσκεται πάνω από την πύλη και οι υπόλοιπες τοιχογραφίες κατασκευάστηκαν το 1848. Στο κέντρο του ναού υπάρχει μαρμάρινο δάπεδο στο οποίο είναι χαραγμένος ο δικέφαλος αετός και ακριβώς πάνω, κρέμεται ο μεγάλος χάλκινος πολυέλαιος του 1848, δωρεά του Πατριάρχη Κυρίλλου Β.
Στη νότια είσοδο του ναού είναι το κωδωνοστάσιο, το οποίο από την μία πλευρά στηρίζεται στον τοίχο της εκκλησίας και από την άλλη στηρίζεται πάνω σε δύο μαρμάρινες στήλες τουλάχιστον πέντε μέτρα ύψος.
Δίπλα από την νότια είσοδο του ναού είναι η περιβόητη πηγή του μοναστηριού, διακοσμημένο με μαρμάρινη πλάκα (δύο κομμάτια) στην οποία είναι χαραγμένος ο δικέφαλος αετός, πουλιά και τρία πρόσωπα από το στόμα του οποίου τρέχει το νερό.
Στο Μοναστήρι από την δεκαετία του ’70 καθιερώθηκε η αναπαράσταση του “νιπτήρα” όπου κάθε Μεγάλη Τετάρτη ο Μητροπολίτης Σάμου, πλένει τα πόδια 12 ιερέων, όπως ο Χριστός έπλυνε τα πόδια των 12 απόστολοι ως ένδειξη της απλότητας του.