Είναι χτισμένο κοντά στην παλαιά πρωτεύουσα του νησιού τη Χώρα και κάτω από το χωριό Μαυρατζαίοι σε υψόμετρο 200 μέτρων περίπου.
Σύμφωνα με την παράδοση που έχει διασωθεί ως και τις μέρες μας, η μονή Τιμίου Σταυρού στη Σάμο ιδρύθηκε το 1592 από τον μοναχό Νείλο τον Λατρινό, έναν από τα δύο αδέλφια - μοναχούς, κτήτορες και της Ιεράς μονής της Μεγάλης Παναγίας στην περιοχή η οποία βρίσκεται σχεδόν αντικριστά από τη μονή Τιμίου Σταυρού, επί Πατριαρχίας του Ιερεμίου του Β'.
Ο Νείλος καθοδηγούμενος, σύμφωνα με την παράδοση, υπό υπερφυσικής προελεύσεως φωτός ανακάλυψε ύστερα από εκσκαφή την εικόνα της Υψώσεως του Τιμίου Σταυρού και για το θαυμαστό αυτό γεγονός ανήγειρε ένα μικρό ναό.
Ο πρώτος ναός που ανήγειρε ο Νείλος παρουσίασε σύντομα κάποια σημάδια σημαντικής φθοράς αλλά και στατικών προβλημάτων, λόγω κυρίως της αστάθειας του εδάφους αλλά και των πολλών υπόγειων ρευμάτων νερού κι έτσι προεβλήθη η επιτακτική ανάγκη της ανοικοδομήσεώς του.
Ο τότε ηγούμενος της μονής Γρηγόριος, καταγόμενος από τους Μαυρατζαίους και αυτός, μαζί με την Αδελφότητα της Μονής πήρανε την απόφαση τον Ιανουάριο του 1838 να προχωρήσουν σε αυτό το έργο της έχοντας προηγουμένως εξασφαλίσει την σχετική άδεια από την ηγεμονική διοίκηση αλλά και την έγκριση του επιχωρίου επισκόπου.
Για την υλοποίηση αυτού του μεγαλεπήβολου στόχου χρειάσθηκε να συνδράμει οικονομικά η τοπική κυβέρνηση όσο και ο πιστός λαός του νησιού στο πλαίσιο ειδικής «ζητείας» που διοργανώθηκε από τους μοναχούς.
Πράγματι, η ανέγερση του νέου καθολικού, που ανήκει στον τύπο της τρίκλιτης βασιλικής με τρούλο, έγινε επάνω στα θεμέλια του παλαιού ναού και πραγματοποιήθηκε σε πολύ σύντομο χρονικό διάστημα και τελικά τα εγκαίνια τελέσθηκαν την παραμονή της πανηγύρεως την 13η Σεπτεμβρίου 1839 από τον τότε Μητροπολίτη Σάμου Θεοδόσιο. Το δεξί κλίτος του Καθολικού αφιερώθηκε στον Τίμιο Πρόδρομο και το αριστερό στην Ζωοδόχο Πηγή.
Ο ξυλόγλυπτος άμβωνας κατασκευάσθηκε το 1843 και επιχρυσώθηκε το 1873, ενώ ο δεσποτικός θρόνος σκαλίστηκε το 1844 και επιχρυσώθηκε το 1877.
Το 1848 πραγματοποιήθηκε η αγιογράφηση του Καθολικού με λαϊκή τεχνοτροπία από τον εντόπιο ζωγράφο Ιωάννη από τη Χώρα της Σάμου, από την οποία όμως διασώζονται πολύ λίγα σπαράγματα στη δυτική πλευρά αλλά και στο ιερό βήμα.
Το ίδιο έτος τοποθετήθηκαν και οι δυο πολυέλαιοι, ένας κεντρικός ορειχάλκινος που κατασκευάστηκε στη Μόσχα και ένας μικρότερος κρυστάλλινος, δωρεές και οι δύο του Πατριάρχη Ιεροσολύμων, Κυρίλλου Β'.
Οι περισσότερες εικόνες του τέμπλου είναι ζωγραφισμένες από τους Κυδωνιείς αδελφούς Βεζυρόπουλους κατά την έβδομη δεκαετία του 19ου αιώνα. Οι εικόνες του Χριστού και της Παναγίας είναι του 17ου αιώνα, ενώ η εφέστιος εικόνα του Τιμίου Σταυρού που βρίσκεται επίσης στο τέμπλο φέρει αργυρή επένδυση του 1776.
Στο σκευοφυλάκιο της Μονής φυλάσσονται αξιόλογα κειμήλια, με σπουδαιότερο τον αστερίσκο που περιέχει Τίμιο Ξύλο, ενώ πολλά κειμήλια έχουν μεταφερθεί στο Εκκλησιαστικό Βυζαντινό Μουσείο Σάμου.
Σημαντικές στιγμές και ορόσημο για την πνευματική ζωή στη Σάμο αποτελούν οι πανηγύρεις της Ιεράς Μονής. Η μονή πανηγυρίζει πρωτίστως την 14η Σεπτεμβρίου κατά τη μεγάλη Δεσποτική εορτή της Υψώσεως του Τιμίου Σταυρού.
Πρόκειται για ένα Πανσαμιακό προσκύνημα το οποίο συγκεντρώνει πιστούς από όλα τα μέρη του νησιού, ενώ πριν από τη Μικρασιατική καταστροφή του 1922 πολλοί ήταν και οι προσκυνητές από την απέναντι όχθη της Ιωνικής γης, ερχόμενοι να προσκυνήσουν τον «Μεγάλο Σταυρό» όπως αποκαλείται ακόμη και σήμερα η Ιερά αυτή Μονή.